Микроскопия

 

Сергей Демченко

С этого момента начну цикл статей о микроскопии и микроскопической технике. Посвящены они будут не основам, а интересным и важным параметрам, характеристикам, фактам и приспособлениям, применяемым в лабораториях.

Как формируется изображение в микроскопе. Помещённый в систему микроскопа образец должен быть дополнительно обработан, чтобы его можно было рассмотреть. Микроскоп (далее М.) – это система, состоящая из ряда линз и призм, которые собирают и направляют световые потоки, доводя изображение в глаза человека. К штанге на шарнире прикреплен тубусодержатель, несущий все остальные части М. С помощью тубуса, в который вмонтированы линзовые системы, можно перемещать их относительно образца для фокусировки. На нижнем конце тубуса расположен объектив. Как правило, микроскоп снабжен несколькими объективами разного увеличения на револьверной головке, которая позволяет устанавливать их в рабочее положение на оптической оси.

Для того чтобы увеличенное изображение в М в принципе было видимым, необходим источник света, который его подсветит, поэтому система освещения является одной из главных и неотъемлемых частей микроскопа. От типа и местоположения осветителя зависит  и методика  исследования и область применения микроскопа. Более подробно о методах освещения мы рассмотрим ниже (Методы освещения и наблюдения). В развёрнутом виде эту статью можно будет прочесть в Интернет версии нашего журнала.

Как видно из иллюстрации для получения изображения в М (рассмотрим биологический микроскоп проходящего света) свет должен пройти от источника света на преломляющее зеркало,  через собирающую линзу (с диафрагмой), далее через конденсор (с диафрагмой, фильтром) он попадает на препарат, после проходя через линзы объектива в пентапризму, которая преломляет поток и разбивает его на несколько направлений (если это бинокулярный или тринокулярный тубус) проецируя изображение в глаза оператора.

Вместо человеческого глаза на конце системы можно расположить электронный глаз. Считывающим устройством может стать фото или видео камера. В этом случае сформированное М изображение проецируется не на сетчатку глаза а на кремниевую матрицу, позволяя данное изображение оцифровать и получить в удобоваримой форме для последующих исследований и длительного хранения. Развёрнуто смотрите в продолжение статьи (Цифровая микроскопия).

Методы освещения и наблюдения

Структуру препарата можно различить лишь тогда, когда разные его частицы по-разному поглощают или отражают свет либо отличаются одна от другой (или от окружающей среды) показателем преломления. Эти свойства обусловливают разницу амплитуд и фаз световых волн, прошедших через различные участки препарата, от чего, в свою очередь, зависит контрастность изображения. Поэтому методы наблюдения в М. выбираются (и обеспечиваются конструктивно) в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов.
Метод светлого поля в проходящем свете применяется при исследовании прозрачных препаратов с включенными в них абсорбирующими (поглощающими свет) частицами и деталями. Таковы, например, тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и т. д. Метод может быть полезен и при наблюдении неабсорбирующих объектов, но лишь в том случае, если они рассеивают освещающий пучок настолько сильно, что значительная часть его не попадает в объектив.
Метод косого освещения является разновидностью предыдущего, отличаясь тем, что свет на объект направляют под большим углом к направлению наблюдения. В ряде случаев это позволяет выявить «рельефность» объекта за счёт образования теней.
Метод светлого поля в отражённом свете применяется для наблюдения непрозрачных отражающих свет объектов, например шлифов металлов или руд. Освещение препарата (от осветителя  и полупрозрачного зеркала) производится сверху, через объектив, который одновременно играет и роль конденсора.
Метод тёмного поля в проходящем свете применяется для получения изображений прозрачных неабсорбирующих объектов, невидимых при освещении по методу светлого поля. Часто таковы биологические объекты. По выходу из конденсора основная часть лучей света, не изменившая своего направления при прохождении через прозрачный препарат, образует пучок в виде полого конуса и не попадает в объектив (который находится внутри этого конуса). Изображение создаётся лишь небольшой частью лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле препарата внутрь конуса и прошедшими через объектив. В поле зрения 6 на тёмном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем преломления.
При наблюдении по методу тёмного поля в отражённом свете непрозрачные препараты (например, шлифы металлов) освещают сверху — через специальную кольцевую систему, расположенную вокруг объектива и называемую эпиконденсором.
Метод наблюдения в поляризованном свете (поляризационная микроскопия) служит для микроскопического исследования препаратов, включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких элементов). К ним относятся многие минералы, зёрна в шлифах сплавов, некоторые животные и растительные ткани и пр. Наблюдение можно вести как в проходящем, так и в отражённом свете. Свет, излучаемый осветителем, пропускают через поляризатор; сообщенная ему при этом поляризация меняется при последующем прохождении света через препарат (или отражении от него), и эти изменения изучаются с помощью анализатора и различных компенсаторов оптических.  Метод фазового контраста (и его разновидность — т. н. метод «аноптрального» контраста) служит для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К числу таких объектов относятся, например, живые неокрашенные животные ткани. Метод основан на том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает т. н. фазовый рельеф), в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф.
Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия) состоит в том, что каждый луч, входящий в М., раздваивается; один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, а второй — мимо неё по той же или дополнительной оптической ветви М. В окулярной части М. оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Как и фазово-контрастная микроскопия, этот метод позволяет наблюдать прозрачные и бесцветные объекты, но их изображения могут быть и разноцветными (интерференционные цвета). Оба метода пригодны для изучения живых тканей и клеток (и часто применяются именно с этой целью).
Метод наблюдения в инфракрасных (ИК) лучах также требует преобразования невидимого для глаза изображения в видимое путём его фотографирования или с помощью электроннооптического преобразователя. ИК микроскопия позволяет изучать внутреннюю структуру объектов, непрозрачных в видимом свете, например тёмных стекол, некоторых кристаллов и минералов и пр.
Метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия) заключается в наблюдении под М. зелено-оранжевого свечения микрообъектов, которое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или не видимыми глазом ультрафиолетовыми лучами. Метод широко применяется в микробиологии, вирусологии, гистологии, цитологии, в пищевой промышленности, при исследовании почв, в микрохимическом анализе, в дефектоскопии. Обилие и разнообразие применений связаны с чрезвычайно высокой цветовой чувствительностью глаза и высокой контрастностью изображения самосветящегося объекта на тёмном нелюминесцирующем фоне, а также ценностью информации о составе и свойствах исследуемых веществ, которую можно получить, зная интенсивность и спектральный состав их люминесцентного излучения.
Ультрафиолетовые лучи невидимы для человеческого глаза. Поэтому изображения в УФ микроскопии регистрируют либо фотографически (с помощью цифровых видеокамер специального назначения цветных и черно-белых), либо с помощью электроннооптического преобразователя или люминесцирующего экрана. Распространён следующий способ цветового представления таких изображений. Препарат фотографируется в трёх длинах волн УФ области спектра; каждый из полученных негативов освещается видимым светом определённого цвета (например, синим, зелёным и красным), и все они одновременно проектируются на один экран. В результате на экране создаётся цветное изображение объекта в условных цветах, зависящих от поглощающей способности препарата в ультрафиолете.

Цифровая микроскопия

     Цифровая микроскопия - новейшее направление современной микроскопии, которая базируется на анализе изображений, получаемых с помощью цифровых комплексов. А также сохранение образцов без срока давности.

Так из чего же, состоит современная цифровая микроскопическая система (ЦМС)? На этот вопрос постараюсь ответить в данной статье, кратко разобрав общие признаки и методики.     Цифровая система состоит из микроскопа, камеры (фото или видео) и компьютера, со специальным программным обеспечением.

     Соединение в единую систему отдельных приборов позволяет получить новые возможности, которыми не обладает ни одна из составляющих сама по себе. Например, ни камера, ни микроскоп, ни компьютер в отдельности не могут измерять оптические параметры объекта, а ЦМС, собранный на их основе, обладает свойством проведения фотометрических измерений.

     ЦМС широко применяются в биологии, медицине, электронике, материаловедении и на производстве.

     Получить достойное изображение исследуемого объекта можно только на профессиональном оборудовании.      Основным критерием оценки микроскопа и системы ввода изображения является уровень используемой оптики.      Также немаловажная характеристика системы ввода изображения - разрешающая способность.

     К ряду преимуществ цифровых микроскопов можно отнести:

• возможность использования компьютерных методов анализа и редактирования изображения;
• сохранение промежуточных и конечных результатов исследований;
• возможность с минимальной трансформацией микроскопа производить наблюдения как визуально, так и на экране монитора;
• при работе с видеокамерами возможность проводить наблюдение и наводку на резкость в режиме on-line на экране монитора.
• возможность передачи результатов исследований на расстояния.

Микрофотографирование и микрокиносъёмка, т. е. получение с помощью микроскопа (М) изображений на светочувствительных слоях широко применяется в сочетании со всеми другими методами микроскопического исследования. Оптическая система М. при микрофото- и микрокиносъёмке требует некоторой перестройки — иной по сравнению с визуальным наблюдением фокусировки окуляра относительно изображения,  выдаваемого объективом.
Некоторые современные М. имеют постоянные (вмонтированные) устройства для микрофотографии, которые позволяют осуществлять такую перестройку и проектировать изображения препаратов сразу на компьютер или монитор (закрытые системы, где цифровой преобразователь уже смонтирован в голову М)  остальные М, могут быть с этой целью оснащено дополнительными принадлежностями.
Микрофотография незаменима при документировании исследований, при изучении объектов в невидимых для глаза УФ и ИК лучах (см. выше), а также объектов со слабой интенсивностью свечения. Микро видео съёмка важна при исследовании процессов, развёртывающихся во времени (жизнедеятельности тканевых клеток и микроорганизмов, роста кристаллов, протекания простейших химических реакций и т. п.).

Одним из основных компонентов современных ЦМС является цифровая видеокамера. В 2010 году произошло обновление модельного ряда видеокамер для микроскопии ТМ GRANUM, в связи с новейшими тенденциями и возможностями считывающих матриц.
Цифровые камеры GRANUM DCМ - это новая оптическая система с полным многослойным просветлением и функцией улучшения частотно-контрастной характеристики изображения, для получения большей яркости и контраста. Изображение яркое и четкое даже на периферийных участках поля зрения.
Цифровые видеокамеры (видеоокуляры) GRANUM DCM разработаны специально для использования с микроскопами, превосходно работа.т со всеми видами оптических микроскопов: биологическими, стереоскопическими, инструментальными.
Система разработана для микроскопов с учётом их специфических особенностей. Главным образом, эта система подходит к микроскопам с окулярным входом типа С-mount (который является стандартом, и используется большинством мировых производителей микроскопов), поле зрения которого 18 мм, и парфокальными объективами. Для микроскопов с монокулярной, бинокулярной или тринокулярной головкой объектив камер DCМ просто вставляется в окулярную трубку вместо окуляра и фиксируется штатным крепежом. Если диаметр окулярной трубки 30мм или 30,5мм (стереомикроскопы), необходимо воспользоваться адаптерами (имеющимися в комплекте).
Для наблюдения за изображением, полученным под микроскопом на экране компьютерного монитора, в комплект входит программное обеспечение, которое включает в себя стандартные инструменты обработки изображений.
Установка цифровой видеокамеры DCM требует минимальной настройки, что позволяет производить ее во время работы с микроскопом. Подключение видеоокуляра к компьютеру осуществляется через порт USB.
 Цифровая камера для микроскопа DCM спроектирована на максимально возможную правильную цветопередачу, что позволяет наблюдать изображение в реальном цвете.
Модельный ряд видеокамер GRANUM DCM представлен системами 1,3Мр, 3,2Мр, 5Мр, 8Мр. А также имеет специальные системы для работы в тёмном поле и во флюорисценции  2 Мр полупоф. и 1,4 Мр проф. системами, которые работают по принципиально иному принципу фиксации изображения и оптику специального состава.  Благодаря такому широкому спектру применения, цифровые камеры подобного типа охватывают практически все направления микроскопических исследований